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离子交换柱层析操作步骤
  • 发布日期:2014-04-09      浏览次数:3616
    •    1.装柱:
        1.1 取出层析柱,用去离子水冲洗干净,连接好管子后固定柱子;
        1.2用水冲洗层析柱3-5次,每次10ml去离子水;
        1.3取出填料,静止至室温后,根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱;
        1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积;
        2.柱的平衡与上样:
        2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱,直至流出液的pH为7.6; 2.2对处理的样品进行过滤后,缓慢上样让蛋白充分结合;
        3.洗杂蛋白:
        3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白,至流出液与缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        3.7用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        (具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)
        4.解离目的蛋白:
        4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
        (具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)
        5.柱的清洗与保存:
        5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱,共冲洗30ml; 5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱,共冲洗30ml; 5.3用过滤去离子水冲洗50ml;
        5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
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